貨號(hào): YJ2273 規(guī)格：25管/24樣
線粒體復(fù)合體Ⅳ試劑盒說明書
可見分光光度法
產(chǎn)品內(nèi)容：
試劑一：25mL×1 瓶，-20℃保存；
試劑二：5mL×1 瓶，-20℃保存；
試劑三：0.5 mL×1 瓶，-20℃保存；
試劑四：液體10mL×2 瓶，4℃保存；
試劑五：粉劑×2 支，-20℃保存；
試劑六：粉劑×2 支，-20℃保存；
產(chǎn)品說明：
線粒體復(fù)合體Ⅳ又稱細(xì)胞色素C 氧化酶，也是線粒體呼吸電子傳遞鏈主路和支路的共有成分，負(fù)責(zé)催化還原型細(xì)胞色素C 的氧化，并終把電子傳遞給氧，生成水。還原型細(xì)胞色素C 在550nm 有特征光吸收，線粒體復(fù)合體Ⅳ催化還原型細(xì)胞色素C 生成氧化型細(xì)胞色素C，因此550nm 光吸收下降速率能夠反映線粒體復(fù)合體Ⅳ酶活性。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
操作步驟：
正式實(shí)驗(yàn)前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做與測(cè)定。
一、樣本的前處理：
組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：
- 準(zhǔn)確稱取0.1g 組織或收集500萬細(xì)菌或細(xì)胞，加入1mL試劑一和10uL試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
- 將勻漿600g，4℃離心5min。
- 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11100g，4℃離心10min。
- 上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的復(fù)合體Ⅳ（此步可選做）。
- 步驟④中的沉淀即為線粒體，加入200uL試劑二和2uL試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10秒，重復(fù)30次），用于復(fù)合體Ⅳ酶活性測(cè)定。
二、測(cè)定步驟：
- 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至550nm，蒸餾水調(diào)零。
- 樣本測(cè)定
- 工作液的配制：臨用前取試劑四、試劑五、試劑六各一支，將試劑五和試劑六依次轉(zhuǎn)移到試劑四中混合溶解。分批配制工作液是為了防止當(dāng)天不能測(cè)完，導(dǎo)致工作液失效。
- 將工作液置于37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）孵育5min；用不完的試劑4℃可保存一周；
- 在1mL 玻璃比色皿中加入40μL 樣本和800μL 工作液，立即混勻，記錄550nm 處初始吸光值A1 和 1min 后的吸光值A2，計(jì)算ΔA=A1-A2。
注意：若ΔA 大于0.2，需將樣本用試劑二稀釋適當(dāng)倍數(shù)（計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)），使A1-A2 小于0.2，可提高檢測(cè)靈敏度。
三、復(fù)合體Ⅳ活力單位的計(jì)算：
- 按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘催化降解1 nmol 還原型細(xì)胞色素C 定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅳ活力(U/mg prot)=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=1099×ΔA÷Cpr
此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。
- 按樣本鮮重計(jì)算
單位的定義：每g 組織每分鐘催化降解1nmol 還原型細(xì)胞色素C 定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅳ活力(U/g 鮮重)=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣÷V 樣總)÷T=222×ΔA÷W
- 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
單位的定義：每1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化降解1nmol 還原型細(xì)胞色素C 定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅳ活力(U/104 cell)=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=0.444×ΔA
V 反總：反應(yīng)體系總體積，8.4×10-4 L；ε：細(xì)胞色素C 摩爾消光系數(shù)，1.91×104 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.04 mL；V 樣總：加入提取液體積，0.202 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬。
